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Membrana cellulare

La membrana cellulare o plasmatica č la struttura che delimita esternamente la cellula, separando il compartimento intracellulare da quello extracellulare.È costituita da un doppio strato (fosfo)lipidico di spessore di circa 5 nm (50 Å) contenente una gran quantitĂ  di proteine.

Per la sua posizione di interfaccia, la membrana plasmatica, oltre alla funzione strutturale, svolge due funzioni essenziali:

  1. la funzione di filtro selettivo, che lascia passare alcune sostanze piuttosto che altre, assicurando cosĂŹ l'integritĂ  biochimica del citoplasma;
  2. la funzione di superficie di comunicazione, permettendo sia lo scambio di informazioni tra l’ambiente intra- ed extracellulare, sia l'interazione fisica con le strutture extracellulari circostanti.
Infine, la membrana plasmatici riveste la funzione di superficie catalitica, dato l’abbondante numero di enzimi ad essa legati, in gran parte coinvolti nella produzione di messaggeri intracellulari.

Secondo il "modello a mosaico fluido", proposto nel 1972 da Singer e Nicolson, il doppio strato lipidico della membrana plasmatica č allo stato di liquido-cristallino ed in esso sono immerse numerose proteine, che grazie alla fluiditĂ  della componente lipidica presentano un notevole grado di mobilitĂ ; ad esse spetta lo svolgimento della gran parte delle funzioni di membrana. Il doppio strato lipidico non ha carattere omogeneo, ma piuttosto all'interno del mosaico fluido sono presenti microdomini lipidici meno fluidi (rafts. Simon e Ikonen, 1997), formati principalmente da sfingolipidi e colesterolo allo stato liquido-ordinato, che funzionerebbero sia da zattere di trasporto di componenti di membrana, sia da piattaforme per la genesi di segnali intracellulari, per cui in essi sono concentrate proteine specifiche.

I lipidi costituiscono circa il 50% della massa della membrana plasmatica, pur essendo molto piů numerosi delle proteine (circa 50 molecole lipidiche per ogni proteina). Le tre principali classi di lipidi delle membrane sono: fosfolipidi (70% del peso lipidico totale), colesterolo (20%) e glicolipidi (5%). I principali fosfolipidi di membrana sono: fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina e sfingomielina; complessivamente queste quattro specie lipidiche costituiscono oltre il 50% dei lipidi di membrana. Altri fosfolipidi, come fosfatidilinositolo, sono presenti in piccole quantitĂ , ma svolgono un ruolo cruciale nella genesi dei segnali intracellulari.

I lipidi di membrana sono molecole anfipatiche, cioč manifestano proprietĂ  sia idrofobiche che idrofiliche. La natura anfipatica č dovuta alla presenza di una estremitĂ  polare idrofila (testa), formata dai gruppi fosfato (PO4), ossidrilico (OH), carbossilico (COOH), aminico (NH2) o ione ammonico quaternario (N+(CH3)3), e di una estremitĂ  apolare idrofoba (coda) formata dalle catene alifatiche degli acidi grassi o dal nucleo ciclopentanoperiidrofenantrenico del colesterolo.

A causa della natura anfipatica, i fosfolipidi e i glicolipidi formano lamine bimolecolari. In ciascun monostrato i lipidi sono allineati tra loro, con le teste polari dirette all'esterno, verso l'ambiente acquoso, e con le code idrofobiche rivolte verso l'interno del doppio strato. L'associazione tra le molecole lipidiche č sostenuta da legami elettrostatici (dipolari e idrogeno) tra le teste e dai deboli legami di Van der Waals tra le catene alifatiche (dipolo indotto-dipolo indotto).

I lipidi di membrana svolgono una funzione strutturale, costituendo l'impalcatura fondamentale della membrana plasmatica; una funzione di barriera semipermeabile, che si lascia attraversare liberamente dalle molecole liposolubili, ma risulta impenetrabile da quelle idrosolubili; una funzione metabolica, in quanto rappresentano una fonte di mediatori lipidici, che possono essere mobilizzati in risposta agli stimoli esterni.

Le proteine sono immerse nel "mare" lipidico e svolgono una serie di importanti funzioni: 1) funzione di trasporto di ioni e molecole; 2) funzione recettoriale, permettendo il riconoscimento di segnali extracellulari; 3) funzione enzimatica, con la generazione di segnali intracellulari, utilizzando le componenti lipidiche delle membrana; 4) funzione di collegamento, fungendo da intermediari nella interazione funzionale tra due proteine (per es. fra recettore ed enzima); 5) funzione strutturale e meccanica, costituendo punti di ancoraggio per strutture extra- e/o intra-cellulari.

Dal punto di vista strutturale, le proteine possono essere distinte, in base alle caratteristiche della loro estrazione dalla membrana, in: integrali e periferiche. Le proteine periferiche possono essere isolate da trattamenti blandi (es. variazioni del pH o della forza ionica del mezzo), mentre le proteine integrali necessitano di trattamenti drastici, che scompaginano la struttura stessa della membrana cellulare. Le proteine integrali si distinguono in: transmembranose, intramembranose e proteine con ancore lipidiche.

Le differenze nelle modalitĂ  di isolamento riflettono le caratteristiche dell'inserimento delle proteine nella membrana. Le proteine integrali sono molecole, che possono attraversare il doppio stato lipidico completamente una o piů volte (proteine transmembranose bi- o poli-topiche), oppure possono attraversarlo parzialmente, emergendo con entrambe le estremitĂ  dallo stesso versante, citoplasmatico o extracellulare, della membrana (monotopiche). I segmenti proteici che attraversano il doppio strato lipidico sono composti principalmente da aminoacidi non polari (idrofobici), soprattutto glicina, leucina, isoleucina, alanina e valina. PoichĂŠ i legami peptidici ( -OC-NH+) tra gli aminoacidi che costituiscono la catena proteica sono essi stessi polari, i segmenti intramembranosi assumono di regola una configurazione adalfa elica, in modo tale che tutti i legami peptidici possono formare tra loro legami idrogeno (O- ••••• H+) riducendo la polaritĂ  del segmento intramembranoso.

Una classe importante di proteine integrali contiene catene lipidiche legate covalentemente alla catena peptidica (lipid-anchored proteins). I gruppi lipidici sono utilizzati come ancore che si inseriscono nella membrana cellulare. Questi gruppi comprendono: acidi grassi (palmitico e miristico), isoprenoidi (farnesilpirofosfato e geranilgeranilpirofosfato) o glicosilfosfatidilinositolo (GPI, molecola complessa formata da lipidi e oligosaccaridi). Le proteine palmitoilate e miristoilate e quelle GPI-legate si distribuiscono di preferenza nei rafts, in quanto le loro catene lipidiche sature hanno una conformazione particolarmente adatta ad essere accolta nei domini lipidici allo stato liquido-ordinato. Al contrario, le proteine isoprenilate, che hanno catene lipidiche ramificate e voluminose, non idonee per i domini allo stato liquido-ordinato, si distribuiscono di preferenza nelle regioni della membrana piů fluide (stato liquido-cristallino). Le proteine GPI-legate sono localizzate esclusivamente nel foglietto esterno della membrana cellulare, mentre quelle legate ad acidi grassi o isoprenoidi sono presenti unicamente nel foglietto interno. Gli acidi grassi e gli isoprenoidi sono legati alla molecola peptidica tramite legame estere con il gruppo tiolico della cisteina. L’idrolisi del legame estere da parte di enzimi specifici permette di regolare l’associazione di queste proteine al versante citoplasmatico della membrana cellulare e quindi di controllarne la compartimentazione fra citoplasma e membrana.

Le proteine periferiche non si inseriscono nel doppio strato lipidico, ma si associano alla sua superficie, intra- o extra-cellulare, interagendo con la la testa polare dei lipidi o con le proteine integrali.Fanno parte delle proteine periferiche associate con la faccia citoplasmatica della membrana cellulare alcuni enzimi e le proteine del citoscheletro spectrina e actina. Le proteine che contengono domini PH (Pleckstrin Homology), come le fosfolipasi C (PLC), si legano ai derivati fosforilati dei fosfatidilinositoli.

Una proprietĂ  delle proteine periferiche consiste nella possibilitĂ  che la loro associazione con la membrana possa essere transitoria e soggetta a regolazione, ad esempio dalla attivazione delle proteine stesse o dei substrati ai quali esse aderiscono. Grazie a questa regolazione le proteine periferiche possono spostarsi fra citoplasma e membrana plasmatica a seconda delle necessitĂ  funzionali della cellula. Alcuni enzimi, come la proteinchinasi C (PKC) e la fosfolipasi A2 (PLA2) si legano alla membrana in risposta alla attivazione da parte del Ca2+ intracellulare.

MEMBRANA CELLULARE - FLUIDITA'

In condizioni fisiologiche, sia le molecole lipidiche sia quelle proteiche in esse immerse sono in grado di muoversi all’interno del proprio monostrato della membrana cellulare. A temperature fisiologiche, la membrana cellulare č allo stato lamellare liquido-cristallino, in cui le catene idrocarboniose dei lipidi sono allo stato fluido, per cui manifestano una notevole libertĂ  di movimento (stato L alfa di Luzzati). Al contrario, allo stato cristallino le catene idrocarboniose presentano una disposizione rigida, parallela alla perpendicolare della superficie del doppio strato (L alfa) o angolata rispetto a questa (L beta’). La temperatura alla quale si verifica la fusione delle catene alifatiche, cioč il passaggio dallo stato cristallino a quello liquido-cristallino, si definisce temperatura di transizione (Tc o Temperatura Critica oppure Tm da melting ).

La maggior parte delle proteine presenta movimenti di spostamento (diffusione) laterale; fanno eccezione le proteine di membrana ancorate al citoscheletro. 
Per quanto riguarda i lipidi di membrana, sono stati descritti diversi tipi di movimenti, che possono essere intramolecolari (1) o intermolecolari (2-4):
1)	Rotazione intorno ai legami semplici C-C
2)	 Rotazione intorno all’asse longitudinale
3)	Rotazione introno all’asse trasversale (la rotazione di 180° porta ad un movimento   di flip-flop)
4)	Diffusione laterale
5)	Movimenti collettivi, come l’ondulazione della membrana

Il movimento intermolecolare si svolge soprattutto in direzione orizzontale (diffusione laterale), oltre che intorno agli assi longitudinale e trasversale della molecola (rotazione e oscillazione), ma solo raramente avviene la rotazione trasversale di 180o, che causa il passaggio della molecola da un monostrato all’altro (movimento di “flip-flop”). Infatti dal punto di vista termodinamico č sfavorevole per una molecola polare penetrare con la sua estremitĂ  idrofila attraverso la parte idrofoba del doppio strato; la spesa di energia č minore nel caso di una molecola lipidica, ma anche in questo caso lo spostamento da una parte all’altra della membrana avviene molto lentamente. Nelle membrane artificiali e naturali, una singola molecola lipidica scambia il posto con quelle vicine con una frequenza di circa 107 volte al secondo e diffonde alcuni micrometri al secondo a 37 °C, con un coefficiente di diffusione (D) di circa 10-8cm2/sec. A questa velocitĂ  di spostamento, una molecola lipidica può diffondere lungo l’intera cellula batterica (≈1 micron) in un solo secondo, mentre può percorrere l’intera circonferenza di una cellula animale in circa 20 secondi.

I movimenti intramolecolari consistono nella rotazione intorno ai legami semplici C-C, che comporta l’isomerizzazione tra le differenti conformazioni della molecola lipidica, in particolare l’isomerizzazione trans-gauche. I movimenti di rotazione dei gruppi metilici e di isomerizzazione trans-gauche sono massimi verso il centro del doppio strato lipidico. La conformazione trans č la piů stabile (minor contenuto di energia) in quanto i gruppi metilici sono alla massima distanza tra loro. Alla configurazione “all trans” (quando tutti i gruppi metilici sono in conformazione trans) la catena idrocarboniosa ha la sua massima lunghezza, in quanto la molecola č completamente distesa, mentre la presenza di conformazione gauche causa un piegamento della molecola. Allo stato cristallino (L beta), le catene alifatiche dei fosfolipidi sono in conformazione all trans, con l’aumento della temperatura l’eccitazione termica delle catene favorisce l’isomerizzazione trans-gauche. PoichĂŠ la percentuale delle conformazioni gauche aumenta con l’aumentare della temperatura, alle alte temperature le catene idrocarboniose dei fosfolipidi sono piů corte.

I principali fattori che determinano la fluiditĂ  della membrana cellulare sono, oltre alla temperatura: 1) lunghezza degli acidi grassi; 2) grado di insaturazione degli acidi grassi delle code dei fosfolipidi; 3) caratteristiche della testa polare; 4) concentrazione del colesterolo nella membrana.

Nei fosfogliceridi si trovano due tipi di acidi grassi: quelli saturi, in cui tutti i legami che gli atomi di carbonio possono formare sono saturati con atomi di idrogeno, e quelli insaturi, nei quali si formano doppi legami tra gli atomi di carbonio. La fluiditĂ  del doppio strato lipidico č in parte dovuta alla abbondanza relativa degli acidi grassi insaturi; in genere l’acido grasso in posizione 2 dei fosfogliceridi č insaturo, tuttavia il grado di insaturazione varia a seconda della specie lipidica, essendo la fosfatidiletanolamina e la fosfatidilserina (prevalenti nel monostrato interno della membrana) piů insature rispetto agli altri fosfolipidi, in primo luogo rispetto alla sfingomielina, che presenta circa il 70% di acidi grassi saturi.

La presenza di catene insature provoca un maggiore disordine nell’allineamento delle catene, rendendo piů fluida la membrana, mentre le catene sature con il loro allineamento piů compatto favoriscono la formazione di un reticolo rigido. Infatti, i doppi legami con configurazione cis (che costituiscono la configurazione di quasi tutti gli acidi grassi insaturi naturali) causano un inginocchiamento della catena idrocarboniosa, per cui si riduce la lunghezza dei segmenti paralleli che interagiscono con le molecole vicine, ottenendo lo stesso effetto di un accorciamento della catena; il massimo effetto si ha quando il doppio legame occupa la posizione intermedia tra la fine della catena ed il glicerolo: allontanandosi il doppio legame dalla posizione intermedia, la lunghezza del segmento parallelo aumenta progressivamente e diventano maggiori le interazioni con le catene vicine. Al contrario I doppi legami in conformazione trans hanno un effetto di gran lunga inferiore sulla fluiditĂ  di membrana, in quanto la catena idrocarboniosa mantiene quasi la stessa conformazione delle catene sature (la sfingosina presenta un doppio legame trans).

Un altro fattore che influisce sulla fluiditĂ  della membrana cellulare č il volume occupato dalla testa polare dei fosfolipidi, che č dipendente dal suo grado di idrofilia. Il volume occupato dalla testa idratata rispetto all’area occupata dalle due catene idrocarboniose influenza lo spazio a disposizione per il movimento delle catene idocarboniose e quindi la compattezza del loro allineamento. Per esempio, le teste della fosfatidiletanolamina occupano poco spazio per la formazione di legami idrogeno tra i gruppi –NH e i gruppi -PO-4, mentre le teste di fosfatidilcolina, prive di gruppi donatori, intergiscono attraverso le molecole di acqua legate, cosicchč l’area occupata da ciascuna testa misura 47-54 Å, molto di piů dell’area di sezione occupata dalle due catene idrocarboniose. Ciò determina una minore vicinanza delle catene idrocarboniose, che possono cosĂŹ formare un minor numero di legami fra loro. Di conseguenza, gli acidi grassi della fosfatidilcolina hanno una maggior libertĂ  di movimento, per cui la fluiditĂ  della membrana risulta aumentata.

          
Il nucleo steroideo del colesterolo ha una struttura planare relativamente rigida, che viene in contatto con i gruppi CH2 prossimali (C1 – C10) delle catene alifatiche dei fosfolipidi. A causa della rigiditĂ  della sua struttura, l’effetto del colesterolo sui fosfolipidi, a temperature al di sopra della Tc, č quello di aumentare l’ordine del tratto prossimale delle catene degli acidi grassi, mentre l’effetto sul tratto distale, al centro del doppio strato lipidico della membrana, č scarso. Al contrario, a temperature inferiori alla Tc, l’effetto del colesterolo č quello di diminuire l’ordine delle catene alifatiche degli acidi grassi e di ostacolarne la cristallizzazione, in quanto interferisce con l’interazione CH2-CH2 tra le catene idrocarboniose dei fosfolipidi.

A causa del maggior contenuto di sfingolipidi e di colesterolo, i rafts presentano un minor grado di fluiditĂ  rispetto alle restanti regioni della membrana plasmatica.

MEMBRANA CELLULARE - ASIMMETRIA

La composizione dei due foglietti, esterno e interno, della membrana cellulare presenta notevoli differenze, non solo nella componente proteica, ma anche nella stessa componente lipidica, per cui la membrana plasmatica č caratterizzata da una marcata asimmetria, che riflette le differenti funzioni dei due monostrati.

In primo luogo i glucidi (oligosaccaridi), che sono presenti nella membrana plasmatica in forma di glico-proteine e glico-lipidi, sono situati nel solo foglietto esterno, in contatto dell’ambiente extracellulare, dove possono svolgere una funzione recettoriale, in particolare nei processi di adesione tra le cellule, oppure una funzione protettiva, formando uno strato (glicocalice) che riveste esternamente la membrana plasmatica, proteggendola dagli insulti meccanici e chimici.

Per quanto riguarda i lipidi, oltre 80% delle molecole che nella testa polare contengono colina (-(CH3)3N+CH2CH2OH-), precisamente fosfatidilcolina e sfingomielina, sono situate nel monostrato esterno della membrana, mentre circa il 90% dei lipidi con teste senza carica netta (fosfatidiletanolamina) o con carica netta negativa (fosfatidilserina e fosfatidilinositolo), sono localizzati di preferenza nel monostrato interno. Ciò comporta una prevalenza di cariche negative sul versante citoplasmatico della membrana cellulare.

L’asimmetria dei fosfolipidi di membrana č generata durante la sintesi della membrana nel reticolo endoplasmatico, nel quale carriers (proteine trasportatrici) di fosfolipidi trasportano specifici fosfolipidi da un monostrato all’altro. Una volta che le neomembrane hanno raggiunto la superficie cellulare, l’asimmetria dei fosfolipidi č mantenuta dalla attivitĂ  coordinata di specifici meccanismi di trasporto.
Negli eritrociti sono stati identificati almeno tre meccanismi: la traslocasi ATP-dipendente specifica per gli aminofosfolipidi, che trasporta rapidamente fosfatidiletanolamina e fosfatidilserina dal monostrato esterno a quello interno; la floppasi ATP-dipendente non specifica, che trasporta lentamente e senza specificità fosfolipidi dal monostrato interno a quello esterno; la “scramblase” (to scramble = mescolare) Ca2+-dipendente non specifica, che consente ai fosfolipidi di muoversi casualmente  tra i due monostrati. 
I primi due meccanismi lavorano in concerto per mantenere la distribuzione asimmetrica dei fosfolipidi, mentre il terzo meccanismo agisce in senso antagonista ai precedenti, provocando un rapido passaggio dei fosfolipidi da un monostrato all’altro, tanto da generare una distribuzione quasi simmetrica dei fosfolipidi di membrana.  

In presenza di fisiologiche concentrazioni intracellulari di Ca2+, la traslocasi specifica per gli aminofosfolipidi e la floppasi non specifica sono attive e mantengono la normale asimmetria di membrana. La loro inibizione arresta il trasporto attivo di fosfolipidi tra i foglietti della membrana, ma per alcuni giorni, in vitro, non risulta nella perdita della asimmetria. Al contrario, l’elevazione della concentrazione intracellulare di Ca2+ attiva la “scramblase” Ca2+-dipendente e inibisce l’attività degli altri due trasportatori, per cui risulta una rapida e casuale ridistribuzione dei fosfolipidi, che compromette l’asimmetria della membrana. La perdita della asimmetria provoca un’aumento degli aminofosfolipidi, in particolare della fosfatidilserina, sulla superficie cellulare, con notevoli conseguenze per la fisiologia cellulare.

Ad esempio, la trasformazione della membrana plasmatica delle piastrine in una superficie procoagulante č causata dalla alterazione della asimmetria dei fosfolipidi, che comporta un’eccessiva presenza di fosfatidilserina sul foglietto esterno; ciò promuove la coagulazione e la trombosi, aumentando la formazione di trombina di oltre un milione di volte. L’esposizione della fosfatidilserina fornisce una superficie catalitica per l’assemblaggio dei complessi enzimatici: protrombinasi (complesso dei Fattori Va e Xa che catalizza la conversione di protrombina in trombina) e tenasi (complesso attivante il Fattore X, composto dai Fattori IXa e VIIIa). Inoltre, l’esposizione della fosfatidilserina nel monostrato esterno rende la cellula riconoscibile ed eliminabile dai fagociti del sistema reticoloendoteliale.


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